达普生物发布数字PCR法的超敏新型冠状病毒(COVID-19)定量检测方案

    新型冠状病毒（COVID-19）自 2019 年 12 月被发现以来迅速在全球蔓延，给全世界人民的生活和健康造成巨大伤害，准确及时的检测是防控新型冠状病毒的关键之一。新型冠状病毒的检测策略通常分为免疫学检测和核酸检测。但在感染初期，病原体抗原含量较低，免疫学检测不易检出。所以核酸检测作为目前检测的主流方法，其中以荧光定量 PCR（RT-qPCR）为主要方案。在一月份，中国疾控和 WHO 就公示了 PCR 检测的引物探针序列，使核酸检测试剂盒得以有效快速的增加，对疫情控制起了非常重要的作用。然而，在临床应用过程中发现，RT-qPCR 方法对于真实病例的检测率约为 30-50%，存在多次检测假阴性的情况，特别是对低感染时可疑样本 (Ct 值在 37-40 之间)的阴性/阳性判定，存在较大争议。造成这一现象的原因：一方面是 qPCR 方法学本身的局限性；另一方面是样品在采集、运输或提取过程中的不合理处置导致的。数字 PCR 技术相比于传统荧光定量 PCR，具有更加出色的灵敏性、特异性和准确性。大量科学研究已经证明，数字 PCR 技术的最低检测限（LOD）会比荧光定量 PCR 低，而且结果重复性更好；同时，能对核酸分子直接进行绝对定量检测，无需标准曲线即能得到准确的样本核酸分子浓度。数字 PCR 技术将对COVID-19 的检测发挥重要的作用，特别是对无症状感染、低感染或潜伏期感染患者的检测，患者在治疗过程中病毒载量变化监测以及病人出院复核等方面，有着突出的潜力。达普生物推出自主研发的星云数字 PCR 系统（Nebula Digital PCR）以及逆转录数字 PCR 一步法试剂（RT-dPCR Universal Mix），并此平台上开发了新型冠状病毒的多重数字 PCR 法检测试剂盒。试剂盒实现在单个反应中针对 orf1ab（open reading frame）、N 蛋白（nucleoprotein）及内控 Rnase 基因区段，进行超敏病毒 RNA 三重定量检测。其中，orf1ab（Cy5 通道）和 N（FAM 通道）基因检测使用中国疾控中心发布的引物探针序列；同时，试剂盒引入美国 CDC COVID-19 检测方案中的 RNase 作为内参，以避免因样品采集、运输和提取不合理而导致的假阴性。

【实验结果】

（1）A 中 FAM 通道 的 1D 散点图阳性点为蓝色（上：N+RNase；中：N；下：RNase），阴性点为黑色；A中 Cy5 通道的 1D 散点图阳性点为红色（上：orf1ab +RNase；中：orf1ab；下：RNase），阴性点为黑色；

（2）2D 散点图（各点簇代表基因：1.orf1ab; 2.RNase; 3.N; 4.orf1ab+RNase; 5.orf1ab+N; 6. N+RNase; 7. orf1ab+N+ RNase）。

      本次测试以 orf1ab 和 N 的假病毒 RNA 提取液以及人类咽拭子 RNA 提取液为样本，模拟在临床中的实际情况。图 2 为数字 PCR 检测结果散点图，显示散 点分离效果明显。图 3 为浓度稀释测定曲线，针对 orf1ab 和 N 基因进行稀释，同时保持内参基因 RNase 的加入量不变。通过图 3 可以观察到，在稀释 10²-10⁵倍区间内（即在 1mL 样本量提取 RNA 的情况下，样本病毒浓度在 10²-10⁵copies/mL），orf1ab 和 N 基因测得浓度结果线性关系显著；同时对于内参基因测得浓度，多次测定结果的 CV 为 4.8%，无显著差异。因此，本检测的新冠病毒检测限为 10² copies/mL，线性检测范围为 10²-10⁵copies/mL。而同类 RT- qPCR 试剂盒，检测限一般为 10³ copies /mL，而且无定量检测能力，同时一般也缺乏内参进行控制。

检测结果展示了新型冠状病毒（COVID-19）多重数字 PCR 法检测试剂盒优秀的性能。1. 超敏的检测能力：更低的检测限可以更早检出病人，也可减少因病毒量过少而误判的阴性；2. 杰出的定量能力：无需借助标准曲线即可直接测得病毒浓度，对病程判断有重要作用；3. 准确的检测结果：一次检测多个基因，同时还引入内参，以发现因为样本处理原因而导致的假阴性结果。

      达普生物目前正在与医院推进临床案例研究，希望在多重数字 PCR 检测上建立一套可靠的检测方案，整合全自动化核酸提取设备、病毒核酸快速提取试剂、数字 PCR 仪、微流控芯片及检测试剂等，推出一整套解决方案。务求降低假阴性风险，提高检测的准确性，为传染性疾病的检测提供更加灵敏、准确的检测方法，为临床提供更多选择。